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第2章 病毒學 Wolfgang Periser, Christian Drosten
由香港、美國及德國的科學家(Ksiazek, Drosten, Peiris 2003a, Poutanen)最先證實，嚴重急性呼吸道症候群(SARS)是由一種新的冠狀病毒(coronavirus)所引起。此種病毒目前暫時被稱為「與SARS有關的冠狀病毒」(SARS-associated coronavirus, SARS-CoV)。 SARS病毒的發現 最初的研究 在中國廣東省流行的「嚴重的非典型肺炎」在2003年2月11日被發表在WHO。起初是認為是一種新型的流行性感冒病毒。在2月19日，研究人員在一位香港病童身上分離出一種鳥類的流行性感冒病毒(avian influenza A, H5N1)這種病毒和1997年在香港爆發的禽流感很類似，故起初專家們認為這又是一種新興的禽流感病毒作祟。然而，這個推論馬上就被排除了。 接著在香港與法蘭克福的病人之呼吸道檢體在電子顯微鏡下發現了似「副黏液病毒」(paramyxovirus)的顆粒，所以研究人員將目標集中在「副黏液病毒」科(paramyxoviridae family)的病毒身上。更進一步的研究發現一種hMPV病毒(human metapneumovirus)出現在許多，但非全部的SARS病人身上。同樣地，接下來的許多試驗都不能證明以上病毒就是SARS的元兇。 在幾乎同一時刻，中國的研究者發現在廣東因此種「非典型肺炎」的死者中都找到了似披衣菌的生物，然而在中國境外的SRAS病患中並沒有找到此類生物。 在3月11日，WHO召集了9個國家的11個實驗室成立了多中心合作組織(multicenter collaborative network)，共同研究SARS的病因，並期待能找出診斷的方法。這個小組的成員利用電話及網路交換他們發現的數據、樣本及試劑，以期能加速找出SARS的元兇。
大突破(The Breakthrough) 香港、美國和德國的科學家終於在3月底被找到了SARS的致病原因！他們在SARS病人身上發現了一種新的冠狀病毒(coronavirus)。而且這次罪證確鑿！在細胞培養、電子顯微鏡、聚合?連鎖反應(PCR)及間接免疫螢光抗體檢驗(indirect immunofluorescent antibody test)中，都證實了這一點！ 三週後的4月16日，WHO在日內瓦與共同合作研究的實驗室開會後，宣布這種從未在人體與動物體內被發現，一種全新的冠狀病毒，為SARS的元兇！這是在10個國家，13個實驗室確認這種新型病毒完全符合確認疾病病因的「科基原理」(Koch’s postulates) 之後所做的宣布。 「科基原理」有以下幾點： 若一個病原體是一個疾病的致病原因，那麼： 1. 該病原體必須在所有病例中都可發現 2. 它必須被從宿主身上分離下來且可在組織細胞培養中生長 3. 此病原可感染新的宿主，且產生相同的疾病 4. 該病原體必須在實驗後感染的新宿主中被發現
研究人員將死亡SARS案例中分離出的病毒，經由猴腎細胞培養後，注到一種南美的猴子(Cynomolgus macaques, Macaca fascicularis)後，猴子也顯現出SARS間質性肺炎的症狀。而且在猴子的鼻子及喉嚨檢體中，一樣分離出同一種病毒，因而證實了科基原理的後兩項條件，因而證明了這種新型的冠狀病毒就是SRAS的致病原因。
冠狀病毒(Coronaviridae) 冠狀病毒（Nidovirales目，冠狀病毒科、冠狀病毒屬）是一群大型、有外套膜(envelope)，帶有單股，即可轉錄的核糖核酸(positive-sense single strand RNA)的病毒，會在動物細胞的細胞質內複製(Siddell)。 冠狀病毒的基因長度約在2萬7千到3萬2千的鹼基對之間，是核糖核酸(RNA)病毒中最大的。病毒體的直徑約在100到140奈米（nanometer, 10-9公尺）之間。大部分的病毒顆粒在電子顯微鏡下可見許多特殊的凸起，每個凸起約20奈米高，所以叫它們冠狀病毒。 冠狀病毒科的病毒以往根據血清學的交叉反應，近來根據較精確的基因序列相似度（見線上資料庫ICTVdB），可分為三類。第一類(Group 1)，包含犬貓感染性腹膜炎(canine, feline infectious peritonitis)、豬隻可傳染性腸胃炎(porcine transmissible gastroenteritis)和豬隻呼吸道病毒(porcine respiratory virus)等等；第二類(Group 2)，包含牛、鼠肝炎(bovine, murine hepatitis)、鼠唾腺淚腺炎(rat sialodacryoadenitis)、人類冠狀病毒(human coronavirus OC43)。第三類(Group 3)只包含鳥類的病毒，如鳥類傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis)、火雞冠狀病毒(turkey coronavirus)等等 在動物身上，冠狀病毒可以造成高致病性的呼吸、腸胃、神經疾病和肝炎。造成一種潛伏期短（2~7天），呼吸道或腸胃炎，就像SARS一樣的動物流行病 (Holmes)。冠狀病毒通常是「高種別性」的(highly species-specific)，亦即一種冠狀病毒通常只能侵犯某一種動物，而不會在各種不同動物之間流傳。在免疫正常的人身上，冠狀病毒的侵犯會被中和抗體(neutralizing antibodies)和細胞免疫反應(cell-mediated immune response)消滅。 某些冠狀病毒可以在動物身上造成全身性致命的疾病，如貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)、豬的血液凝集腦脊髓炎病毒(hemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV) of swine)、某些種類的鳥類傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus, IBV)和鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)。這些冠狀病毒可在肝臟、肺臟、腎臟、腸道、脾臟、腦、脊髓、視網膜及其他組織中進行複製 (Holmes)。他們是經濟上很重要的家禽家畜之重症疾病。 人類冠狀病毒 (HCoVs) 原先只引起輕微的疾病。這類冠狀病毒屬於前述第一類 (HCoV-229E) 和第二類 (HCoV-OC43) 的冠狀病毒，通常為引起輕度呼吸道疾病的主要病原體之一。該病毒偶爾會導致幼童和成人下呼吸道的重度感染，以及引起新生兒壞死性腸炎(necrotizing enterocolitis) (McIntosh, El-Sahly, Folz, Sizun)。 上述已知的人類冠狀病毒(human coronaviruses)可在自然環境表面存活達三小時以上 (Sizun)。冠狀病毒可能是藉由飛沫、污染的手、病媒、或是微小的氣態顆粒在人與人之間傳播 (Ijaz)。 SARS冠狀病毒 (SARS-related CoV) 似乎是會造成人類重症疾病的第一個冠狀病毒。
SARS冠狀病毒(SARS CoV) 基因序列(Genome Sequence) 2003年四月，由加拿大研究團首先發表新冠狀病毒的完整基因序列，二天後，美國疾病管制局 (CDC) 也接著完成新冠狀病毒的基因定序 (Rota)。 SARS冠狀病毒的基因序列顯示，此種新病毒不屬於包括兩類人類冠狀病毒HCoV-OC43和HCoV-229E在內的任何已知冠狀病毒群(group) (Drosten, Peiris, Marra, Rota)，SARS冠狀病毒和這類病毒群只有中等程度的相關性。SARS冠狀病毒基因組序列顯示，其和所有的已知群組都有差距。鼠、牛、豬、第二類人類冠狀病毒以及第一類鳥禽冠狀病毒和SARS冠狀病毒最接近。最新的序列資料和刊物請見 NCBI 的網頁http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/SARS/SARS.html。 目前，已提出將此新冠狀病毒定義為冠狀病毒的第四個株系(lineage) (Marra)，即第四類(Group 4)。SARS冠狀病毒的基因序列分析顯示此病毒與最初的假說一致： 新冠狀病毒可能是未知其正常宿主的一種動物冠狀病毒，但最近此種病毒已發展出可感染人類並在人體內繁殖的能力，而且具有跨越物種屏障，交叉感染的能力 (Ludwig)。其基因組顯示SARS冠狀病毒非任一已知冠狀病毒的突變種，也不是已知冠狀病毒之間基因重組的結果。 當病毒傳播至人類身上，SARS冠狀病毒顯然地能保有其一致的基因型，而且在人類宿主的體內似乎適應良好 (Ruan)。
型態學 患者標本及細胞培養上清液的負染穿透式電子顯微鏡(negative-stain transmission electron microscopy)觀察顯示此為多型性、被有外套膜的冠狀病毒樣的顆粒，直徑介於60 - 130 奈米(nm)之間(Ksiazek, Peiris)。 用薄片電子顯微鏡(thin-section electron microscopy)觀察被感染的細胞顯示冠狀病毒樣的顆粒位於由細胞膜包圍的空泡(cytoplasmic membrane-bound vacuoles)中和粗面內質網(rough endoplasmic reticulum)的內胞漿網槽(cisternae)中。胞外顆粒聚集成簇，常見於胞漿膜的表面上(MMWR 2003; 52: 241-248)。 組織結構
SARS冠狀病毒的基因組包含五個主要的起始轉讀片段(open reading frames, ORFs)，分別轉錄出複製?(replicase)、突起(spike, S)、外套膜(envelope, E)和膜(membrane, M)的糖蛋白(glycoprotein)，及核蛋白殼蛋白質(nucleocapsid protein, N)。 S蛋白質的主要功能是用來連接特定種的宿主細胞接受體(receptors)，並引發病毒外套膜和宿主細胞膜進行融合。最初感染所具有的種特異性(species specificity) ，大多數是依靠特定接受體的交互作用造成。此外，S蛋白質也是決定各種不同冠狀病毒毒力因素 (virulence factor) 之一。且S蛋白質也是主要的病毒抗原(viral antigen)，會引起宿主產生中和抗體(neutralizing antibody)。 M蛋白質是病毒顆粒(virion)外套膜的主要成份之一。在病毒複製後進行組合的期間，M蛋白質是病毒顆粒形態的主要決定因素，而且會挑選S蛋白質插入膜上，完成病毒的組裝。 高比率核糖核酸之間的重組(RNA-RNA recombination)是冠狀病毒RNA合成時一個值得注意的特徵。
檢測 SARS冠狀病毒在多種檢體樣本中已可被檢測出來，包括：透過病毒分離技術 (virus isolation)或聚合?連鎖反應(PCR)可在肺臟和腎臟的抽取物中檢測到；透過病毒分離技術(virus isolation)、電子顯微鏡和聚合?連鎖反應 (PCR)，可在支氣管肺泡灌洗液中檢測到；透過聚合?連鎖反應(PCR)可在痰液或上呼吸道拭棒 (swab)、吸出物(aspirate)、沖洗液(wash)樣本中檢測到SARS冠狀病毒 (Ksiazek, Drosten)。 痰液中可檢測到高濃度的病毒核糖核酸(viral RNA)，每毫升可高達一億個病毒 (Drosten)。在剛開始發病時（平均在開始發病後3.2天）有32%的患者及在發病後第十四天有68%的患者，透過即時聚合?連鎖反應(RT-PCR)可在鼻咽部的吸出物中檢測到SARS冠狀病毒的核糖核酸(SARS-associated coronavirus RNA) (Peiris 2003b)。97%的患者在發病兩週後可在糞便樣本中檢測到病毒核糖核酸 (viral RNA)。42%尿液樣本的病毒核糖核酸(viral RNA)檢測結果為陽性(Peiris 2003b)。 在急性期的血清中及較晚的恢復期的糞便中，也可檢測到極低濃度的病毒核糖核酸(viral RNA)，這表示病毒隨糞便排出的時間較長(Drosten)。
穩定性和抵抗力(Resistance)
評估SARS冠狀病毒的穩定性，及其對週遭各種不同環境因子和清潔劑的抵抗力的研究工作仍在進行。 由世界衛生組織 (WHO) 多中心合作組織(multicenter collaborative network)成員對SARS診斷的研究所獲得的初步結果顯示：室溫下，病毒可在糞便和尿液中穩定存活至少1 – 2天 (http://www.who.int/csr/sars/survival_2003_05_04/en/index.html)。 在腹瀉患者的糞便中 (pH值比正常糞便高)，其穩定性似乎更高。(註記一) (譯者註：中國大陸研究顯示在人的痰、糞便、尿液以及血液中，SARS病毒能長時間保持活力，攝氏24下，痰和糞便中存活約5天，尿液中存活約10天，血液中可存活15天。在室內條件下，濾紙、棉布、木塊、土壤、金屬、塑料、玻璃等表面可存活3天。研究顯示含氯消毒劑和過醋酸，幾分鐘內完全可以殺死糞便和尿液中的SARS病毒，應用紫外線照射，在距離為80到90公分，大於每平方公分90微瓦條件下，30分鐘可殺滅體外SARS病毒。 另外，SARS病毒隨著溫度的升高，病毒存活率顯著下降，無血清培養條件下，攝氏37度可存活4天，56度加熱90分鐘，75度加熱30分鐘，病毒就會被消滅。) 在經過21天在4℃和-80℃的環境中，受感染的細胞培養中的懸浮液，其病毒濃度只有輕微下降。而在經過室溫處理48小時後，病毒濃度也只下降一個對數級數。這證明了SARS冠狀病毒在這樣的環境之下比其他已知的人類冠狀病毒更加穩定。然而加熱到56℃卻會使SARS冠狀病毒的活性快速下降。除此之外，SARS冠狀病毒在經過多種常用的消毒劑和固定劑處理後也會失去其傳染力。 自然寄主 在香港和Shenzhen的研究團隊發現，許多冠狀病毒在基因方面和在南中國野生動物供人消費市場內動物體內的SARS冠狀病毒十分具有關聯性。他們發現此病毒存在於蒙面平板麝貓(白鼻心masked palm civets, Paguma larvata)和一些其他的物種。在經過細胞培養和PCR分子學技術檢測後發現，被研究的全部六種麝貓都被發現帶有SARS冠狀病毒。這些動物的血清，也可以抑制來自人體的SARS冠狀病毒生長，反之亦然，感染SARS的人類的血清，也可以抑制來自這些動物體內的SARS冠狀病毒。由這些動物分離出來的病毒的基因序列顯示，除了多了一小段額外的序列，其餘都和人類SARS冠狀病毒完全相同。 這研究，提供了第一個表示SARS冠狀病毒除了人以外，具有其他寄主的觀點。然而到目前為止，尚無任何證據能表示這些野生動物物種在SARS爆發的流行病學觀點上扮演重要角色。在中國市場上賣的麝貓出生於野外，被捕且被飼養於田中。所以他們可能從野生動物那兒得到了病毒。因此要得到任何確定的結論需要作更多的研究。 抗病毒製劑和疫苗 抗病毒藥物 目前在體外以各種不同的規範評估有效的抗SARS藥物正在努力的進行中。根據到目前為止的資料顯示，一種廣效型藥劑可有效抵抗RNA病毒且現在被用於SARS病人的Ribavirin，在體外測試是無效的。最近發現甘草根內的一樣物質Glycyrrhizin，被發表在體外測試具有抗SARS的效果。 更進一步的研究包括對SARS冠狀病毒蛋白的物理化學分析，將使根據標的之藥物設計(drugs design based on target)的新物質被發展出來。 疫苗 到目前為止，除了雞的感染性支氣管炎病毒以外，沒有抗呼吸性冠狀病毒的商業型動物疫苗。雖然有效的疫苗不能期待在近期可以獲得，但是體外繁殖SARS冠狀病毒和抗動物冠狀病毒疫苗（鳥類感染性支氣管炎病毒、豬隻傳染性腸胃炎病毒、貓感染性腹膜炎病毒）的獲得，這兩樣相對簡單的事，卻正在進行中。S蛋白質一般來說是疫苗很好的目標，因為它會使中和抗體的數量提升。 SARS冠狀病毒明顯的基因穩定性使得疫苗發展被注重。然而必須注意到的是，實驗室中感染人類冠狀病毒229E，是不會具有長時間的免疫力的。同樣的許多動物冠狀病毒會再次復發感染，所以要擁有長時間免疫力是難以達成的。雖然如此，再次復發感染，一般來說似乎都較輕微或甚至無症狀。
展望 發現SARS相關的冠狀病毒是由WHO協調且空前全球合作行動的結果。這樣快速成功的結果歸因於合作，而非競爭。各個高超研究員為了發現此新病源體運用包括細胞培養、電子顯微鏡和分子生物學的各種可用技術。這證明了對付21世紀緊急傳染性疾病的威脅，合作是一個很好的方法。 控制SARS的傳染性需要發展明確對SARS病人的診斷測試方法、監控它的散佈以及疫苗和抗病毒物質去預防以及治療這疾病。疫苗在預防動物冠狀病毒感染上非常成功，而發展預防其他新的冠狀病毒的有效疫苗是相當可能的。然而以疫苗抵抗動物冠狀病毒並非百分之百有效。如同發展其他疫苗一樣，這都需要時間的。適當的動物模式測試必須證明有效，且為了證明新疫苗用於人體的安全性，長時間的觀察也是必要的。 此外，根據不同的實驗方法可以解決不同的問題。目前仍有有許多重要且著眼於SARS相關冠狀病毒的自然史的問題被提出如下，有待進一步的研究。 l SARS冠狀病毒的來源？假如有動物帶原者，是什麼？假如SARS冠狀病毒存在未知的動物中，它會不會因為特定組合的隨機突變而感染人類？或SARS冠狀病毒這種新型的冠狀病毒，可以同時感染原來的寄主和人類嗎？ l 哪一個因素決定SARS被感染和具有傳染性之間的期間長短？ l 在感染期中何時病毒放出量最高？在體內不同區域的病毒濃度是多少？為什麼病毒量和病情嚴重度或傳染可能性有關係？ l 有沒有健康帶原者的存在？如果有，這些帶原者是否會釋出足以致病的量以及濃度的病毒？ l 病毒傳播的情形在症狀逐漸康復的時候仍然繼續發生嗎？如果是，將持續多久？這種情形有傳染病學上的相關性嗎？ l 為什麼小孩子較不容易感染SARS？他們只是臨床症狀的表現比較不明顯，還是他們具有免疫力能夠對抗SARS冠狀病毒？ l 感染潛在幫助因子，例如披衣菌和hMPV病毒，扮演什麼樣的角色？它們是跟造成更嚴重的臨床症狀有關，還是使得傳染可能性提升（所謂的「超級傳播者」(super-spreaders)）？ l 有沒有環境中的SARS冠狀病毒傳染來源，例如食物、水、以及污水？ l SARS冠狀病毒在各種環境下的穩定程度如何？我們如何能夠達到有效的消毒呢？病毒能夠在包括乾燥的表面、懸浮空氣中，和排泄物上面存活多久呢？ l 在SARS冠狀病毒品系之間的基因變異性之重要性為何？
圖片一 似冠狀病毒的顆粒在細胞培養中的電子顯微鏡圖片，經過離心之後顆粒懸浮在表層，並用醋酸鈾試劑做反染色。 （來源：Department of Virology, Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine; Director: H. Schmitz；原圖見http://SARSReference.com/archive/coronavirus_em.jpg）
圖片二 比較：受到SARS相關的冠狀病毒感染，培養24小時後的細胞性病變與沒有受到感染的細胞的不同。 （來源：Institute for Medical Virology, Director: H. W. Doerr；原圖見：http://SARSReference.com/archive/cytopathiceffect.jpg, http://SARSReference.com/archive/uninfectedcells.jpg）
圖片三 和SARS病毒有關的冠狀病毒種系發生樹狀圖。 （來源：Günther, Department of Virology, Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine; Director: H. Schmitz；原圖見：http://SARSReference.com/archive/phylogenetictree.jpg）
參考資料(References)
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譯者註：基於連接網站在許多重要訊息值得參考，雖然原書沒有記載，仍將其附註於此，希望對讀者有所助益。
註記一: WHO之實驗室對SARS冠狀病毒的穩定性及抵抗性資料
SARS病毒在糞便及尿液之中的存活力 ² SARS病毒可在室溫下於糞便及尿液中存活至少1~2天 ² 在腹瀉患者的糞便中（pH值較一般糞便高），SARS病毒可以存活更久（可存活至4天） 消毒劑 ü 暴露在許多一般的消毒劑後，SARS病毒會失去其傳染力 病毒在細胞培養的上清液中的存活力 ü 在℃及-80℃的環境下，經過21天，SARS病毒濃度仍然只有微量的減少 ü 病毒濃度在室溫下降低一個對數級數需要2天。這顯示SARS冠狀病毒比以往所知的任何冠狀病毒來的穩定 ü 加熱至56℃可以每15分鐘10000單位的速度消滅病毒（病毒量快速減少） 固定劑(fixatives)（僅用於實驗室） ü 在室溫下，進行免疫螢光反應時，將SARS病毒固定在玻片是不會殺死SARS病毒的，除非將丙酮冷卻至零下20℃
*GVU: Government Virus Unit, Dept of Health, Hong Kong, SAR, China QMH: Queen Mary Hospital, The University of Hong Kong, SAR, China NIID: National Institute of Infectious Disease, Tokyo, Japan UnivM: University Marburg, Germany
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