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第七章 診斷試驗 Wolfgang Preiser， Christian Drosten
序論
儘管最初在引起SARS原因的發現(參見章節2：病毒學)，以及診斷測試的早期發展進展迅速，然而，關於SARS實驗檢測建立的進展，比原先預期的還慢。
根據當前WHO世界衛生組織的建議，雖然世界各地已有不同小組研發各種以PCR為基礎的分子分析化驗，並且能夠透過商業途徑可得，但仍然不應該以這些測試的結果來排除疑似感染SARS的病例。
由於一直以來缺乏有助於迅速診斷疑似感染SARS病例的實驗室試驗，使研發小組較優先對診斷測試這個領域，做進一步的研究努力(WHO, Update 71)。
在許多由病毒引起的疾病中，早期症狀階段期間，病毒釋出是最明顯的症狀，換言之也就是指緊接著在症狀發作前後即可被觀察到。不幸地，在SARS感染初期，病毒釋出量相對地較低。SARS病毒在臨床病症發作10天前後，才明顯可在呼吸道分泌物和糞便排泄物中觀察到。為了於病症初期能及時診斷，因而必須要使用即使在病毒基因物質量低時，仍能夠偵測出病毒存在的高度敏感測試。
由於目前現有的測試，一般尚不能夠偵側出初期少量的SARS coronavirus (SARS-CoV)，所以這些測試對於病人處理和病況控制方面無多大用處。因此，感染SARS的患者有可能在病症初期把病毒傳染給其他人，所以必須以可靠的方法檢查診斷出，然後迅速隔絕(WHO, Update 71)。
目前已可得最首先有關於SARS的臨床研究結果，而且這些研究對於不同的病患、不同的時間點，明顯助於各種有效的臨床測試。在其中一系列記載，平均20 天時，93%的患者免疫球蛋白IgG有血清血轉換(IgG seroconversion)的現象；大約50 %的患者在症狀發作後的15天前後有血清血轉換(seroconversion)的現象(Peiris)。
同樣的研究中，經由RT-PCR，於20名患者(32﹪)初期症狀時(平均在病狀發作後的3.2天)以及另外68﹪患者第14天的鼻咽吸出物中，可偵測到引起SARS的冠狀病毒核糖核酸RNA (Peiris)。這樣的偵測量化方式顯示，病毒量在第10天時達每毫升1.9*107個數(copies per ml)，而第5天與第15天，則各分別是每毫升2.3*105個數與每毫升9.8*104個數 (Peiris)。
再者，97﹪症狀發作後晚期(平均在發作後的14.2天)，收集的糞便抽樣中，可偵查到病毒核糖核酸RNA。同樣地，42﹪平均在症狀發作後15.2天，收集的尿液樣品中可偵查到病毒核糖核酸RNA (Peiris)。
作者們因此認為，雖然病毒核糖核酸RNA，僅僅只在32﹪症狀表現初期的鼻咽吸出物中可被偵查測出，然而，經過多次的鼻咽和糞便樣本測試仍能夠增加RT-PCR分析化驗的預期值(Peiris)。
實驗室檢查
在世界衛生組織WHO領導下，通過國際多中心實驗室合作網對SARS進行檢測，使得對新的冠狀病毒的研究突飛猛進（SARS：2003年4月29日實驗診斷檢查測試；http://www.who.int/csr/sars/diagnostictests/en/）。已對一些國家的疑似及可能病例樣本進行了針對SARS-CoV的檢查，這些國家包括：加拿大、法國、德國、香港、義大利、荷蘭、新加坡、英國和美國。
但是，在能檢測病毒及其抗體的標準試劑可取得，及其檢測方法已被足夠地測試應用前，SARS診斷仍依靠臨床和流行病學資料。從2003年5月1日起，修改後的疾病定義（見：http://www.who.int/csr/sars/casedefinition/en/）首次包括了實驗室結果：如果SARS疑似病例在一次或多次化驗中有SARS-CoV陽性，那麼該病例應進一步被歸類為可能感染病例。SARS-CoV檢查測試結果目前沒有明確的檢測判斷標準來確認或排除SARS感染的診斷。
其它可以引起非典型肺炎的病原體，如退伍軍人桿菌、流感和副流感病毒、黴漿菌肺炎(Legionella
pneumonia, influenza and parainfluenza viruses, Mycoplasma pneumoniae)等，如果實驗室檢查結果陽性，則可作為SARS的排除標準：根據SARS疾病定義，如果有另外的診斷可以完全解釋此一病例，那麼這一病例即可排除SARS病毒感染。然而，一定不要排除雙重感染的可能性。
分子生物學檢查
通過多聚?鏈反應（PCR）可檢測出各種標本如血、便、呼吸道分泌物或組織中
SARS-CoV特有的病毒核糖核酸RNA。由世界衛生組織WHO實驗室網絡成員提供的許多PCR科學資料可在WHO網站上獲得
(http://www.who.int/csr/sars/primers/en/)。另外，由Bernhard
Nocht研究所(http://www.bni-hamburg.de/;
Drosten et al.)研發的一套包含引子(primers)及陰陽性對照(positive
and negative controls)的5?-核酸?RT-PCR試劑盒(5´-nuclease
RT-PCR test kit)可透過商業途徑購得(http://www.artus-biotech.de/)。透過歐洲外來引進病毒感染網站
European Network for imported Viral infections (ENIVD；http://www.enivd.de/)可獲得診斷用的滅活性標準製品。ENIVD還備有SARS-CoV分析化驗的國際外部品質評估方案(international
external quality assessment scheme)。
儘管現存的PCR試驗有時高度敏感，但其並不能確定地排除病人SARS病毒的存在 (Peiris, McIntosh, Poon)。反之，實驗室污染的樣本可導致偽陽性結果。因此，世界衛生組織WHO(http://www.who.int/csr/sars/labmethods/en/)提出了嚴格的實驗室品質控制指南和統一檢測的要求。
有效的陽性PCR結果顯示出：檢測樣本存在由SARS-CoV而來的基因物質(核糖核酸RNA)。然而，這並不意味著存在病毒即存在感染，或已存在足量的病毒感染給其他人。
而陰性的PCR結果也不能完全排除SARS。可能會有因為PCR敏感度不足，而造成的偽陰性(false-negative)、或是檢體採集的時機不對，沒有採到病毒或病毒的基因。
目前，專家們正致力於增加PCR的敏感性，以利臨床應用。其中一種方法是除了之前使用的聚合脢基因(polymerase gene)，再將SARS-CoV的另一個基因也做PCR放大。基於冠狀病毒特殊的轉錄方式，專家們認為針對核蛋白(nucleoprotein)做的PCR可能會有較高的敏感度。這種方法目前正在評估中，而他的實驗設計可在Bernhard Nocht Institute取得。
病毒的分離
我們可藉由將病人的檢體（如：呼吸道分泌物、血液、糞便檢體）接種到適當的活細胞中（如：Vero cells），來偵測有感染力的病毒是否存在此病人體內，並可藉此方法將病毒增殖。分離出病毒後，還需以更進一步的測試鑑定是否為SARS-CoV。細胞培養是一個吃力的工作；但目前除了動物試驗，這是唯一可以偵測到活病毒的方法。細胞培養必須在三級生物安全（biosafety level 3(BSL-3)）以上的設備內進行（後述）。若細胞培養的結果呈陽性，表示有活的SARS-CoV存在此檢體中；但若結果呈陰性並不能完全排除SARS（同PCR測試法）
抗體偵測法
有很多方法可以偵測出免疫系統受SARS-CoV侵入後所產生的抗體。不同種類的抗體（免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)）會在感染的過程中依次出現並伴隨著量的改變。在感染的早期可能還偵測不到這些免疫球蛋白。而免疫球蛋白G(IgG)通常則是在疾病解除後仍可偵測到。
目前已發展出下列的測試方法： – 酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA))：偵測SARS病患血清中的免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)。大約在症狀發生的21天後使用才準確。
– 免疫螢光分析法（Immunofluorescence assay (IFA)）：這個方法是先將已經被SARS-CoV感染的細胞固定在顯微鏡玻片上，然後加入患者的抗體（若病人為SARS病患，則會有能和SARS-CoV病毒抗原結合的抗體），最後用有螢光標記的二級抗體（secondary antibodies）在螢光顯微鏡下來偵測是否有免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白M(IgM)結合在細胞上。免疫螢光分析法（IFA）通常在症狀發生後10天可測出是否為SARS感染。並且可經過一連串的稀釋滴定來將病人血清中的抗體定量。目前，偵測SARS-CoV的抗體的免疫螢光分析法(IFA)已經可在Euroimmun AG購得 (Seekamp 31, D-23560 Lübeck, Germany; http://www.euroimmun.de/)
– 中和試驗法（Neutralization test (NT)）：這個測試方法是在細胞培養中，用滴定的方法來評估病人血清中和SARS-CoV感染的能力，並可加以定量。因此，這個試驗的結果很可能和患者的免疫力有最佳的相關。但是因為要用到具感染力的病毒，所以要在三級生物安全（biosafety level 3 (BSL-3)）以上的設備內進行。
結果的解釋
若抗體偵測結果呈陽性，則代表曾感染了SARS-CoV。而從無抗體到有抗體的血清轉換(seroconversion)，或是抗體力價(titer)從急性期到恢復期上升了四倍，都代表最近感染過SARS-CoV。另一方面，若在發病21天後，抗體偵測結果仍呈陰性，就很可能不是感染了SARS-CoV。到目前為止，似乎沒有已經篩檢過SARS-CoV的控制族群(control population)的血清盛行率(seroprevalence)資料。抗體偵測法提供了SARS-CoV感染的間接診斷方法；雖然在急性期不適用，但和其他的測試方法比起來，抗體偵測法比較不受檢體種類和時機的限制。
限制
到目前為止，所有SARS-CoV測試方法都有限制，所以在依照濾過性病毒測試法來做決定時，一定要格外小心。細節可參見 WHO Update 39, "Caution urged when using diagnostic tests"(註記一)http://www.who.int/csr/sarsarchive/2003_04_25/en/。有時，偽陰性結果（可能因敏感性低、不適當樣本、採樣時間等等）會產生對於安全性的假認知，最糟糕的是，會讓一個攜帶著SARS病毒、甚至可能傳染給他人的人，脫離觀察的範圍。
要更瞭解SARS，WHO建議如下：從疑似或可能病例、以及他們的密切接觸者（即使未感不適），所採集到的連續樣本，都必須保留起來。這對先前未曾發生過SARS的國家，一旦出現首例時是相當重要的。臨床病史及接觸病史也要收集，以更瞭解病毒顆粒釋出（shedding）方式，以及可傳染的時期（period of transmissibility）。這些患者的樣本應該要適當地做病毒培養、PCR、抗原偵測、免疫染色 及/或 血清抗體偵測。可參見"Sampling for Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) diagnostic tests"(註記二),http://www.who.int/csr/sars/sampling/en/)。WHO也鼓勵每個國家指定一個參考實驗室（reference laboratory）來調查研究可能的SARS病患的標本。
生物安全性的考量
至今，沒有一個實驗室感染SARS-CoV病例相關報導。然而，WHO在2003年4月25日聲明了「生物安全指南」（biosafety guidelines）(註記三)，內容是：處理和SARS有關的臨床標本，以及源於SARS實驗室的材料。可參見http://www.who.int/csr/sars/biosafety2003_04_25/en/。必須採行恰當的方法，來預防經由飛沫小滴、空氣、及/或污染的表面與物件等的散佈潛力，尤其強調避免無防備地製造的霧氣（unguarded production of aerosols）。
對於：例行的血液診斷測試、操作已知去活化（經溶解、固定或其他處理方式）的病毒顆粒，及/或無感染力部分的不完全病毒基因組、例行的黴菌和細菌培養、及標本最後包裝在一密封無污染的容器送到實驗室做更多的測試，適當的二級生物安全措施（BSL-2）已是足夠的。任何可能引起飛沫的步驟，應該在生物安全性下執行，且實驗室工作人員除了應穿上標準防護如手套等之外，還要戴上防護鏡、外科面具。
若是為求病因的體外（vitro）細胞培養，以及操作牽涉到生長或濃度的實驗，就必須要三級生物安全措施（BSL-3）。
國際空運協會（International Air Transport Association (IATA)）公布最新的「危險物品章程（Dangerous Goods Regulations (2003)）」，允許已知或懷疑含SARS物質的標本，在診斷或調查目的下，可運輸作為UN 3373 ”診斷標本”（transported as UN 3373 “Diagnostic Specimens”）。而其他目的、及培養病原的標本，則運輸作為UN 2814，並標示為 ”感染物質，影響人類(嚴重急性呼吸道症候群病毒）”（"Infectious substance, affecting humans (Severe Acute Respiratory Syndrome virus)"）。將被運輸的所有標本，必須被包裝在三級包裝（含三層包裝）。關於污染設施和生物安全實踐，進一步的詳細資訊可在「WHO實驗室生物安全指南第二修改版（WHO Laboratory Biosafety Manual, 2nd revised edition）」找到，亦可到WHO網站(註記四) (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Labbiosafety.pdf)。
展望
除了更快的診斷出SARS感染之外，診斷方法的有效度也有助於說明一些重要問題，如：康復期（convalescence）病毒釋出（和可傳染(communicability)）的時段、病毒出現在不同體液與排泄物、及潛伏期（incubation period）時病毒是否已釋出。
直到SARS-CoV實驗方法到達某一程度的標準化及品質保證，實驗結果就必定會用在臨床。嚴密關切WHO的更新說明（updated recommendations），及與這些測試的效性和用途相關的國家組織，是相當明智的。若有任何疑義，可參 http://www.who.int/csr/sars/labmethods/en/)。
附表一、
圖片一、免疫螢光分析法（IFA）：在感染了SARS-CoV的Vero細胞培養中加入發病後11天的病患血清(1:50稀釋)，圖中可見細胞質發出螢光。（資料來源：Institute for Medical Virology, Director: W. Doerr）http://www.sarsreference.com/archive/verocells_patientserum.jpg
圖片二、免疫螢光分析法（IFA）：在感染了SARS-CoV的Vero細胞培養中加入對照組（negative control）血清。（資料來源：Institute for Medical Virology, Director: W. Doerr）http://www.sarsreference.com/archive/verocells_controlserum.jpg
圖片三、經由"TaqMan" (5'nuclease) real-time PCR的放大，來偵測臨床標本的 SARS-CoV RNA。這是一個廣為使用的方法，由BNI發展。引子（primers）及螢光物質標定的探針（fluorescence-labeled probe）位在SARS-CoV的複製脢基因（polymerase gene）上。 （資料來源：Institute for Medical Virology, Director: W. Doerr）
參考資料
1. Drosten C, Gunther S, Preiser W, et al. Identification of a Novel Coronavirus in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome. N Engl J Med 2003; 348:1967-76. Published online Apr 10, 2003. http://SARSReference.com/lit.php?id=12690091 2. McIntosh K. The SARS coronavirus: rapid diagnostics in the limelight. Clin Chem 2003; 49: 845-6. http://SARSReference.com/lit.php?id=12765977 3. Peiris JS, Chu CM, Cheng VC, et al. Clinical progression and viral load in a community outbreak of coronavirus-associated SARS pneumonia: a prospective study. Lancet 2003b; 361:1767- 72. Published online May 9, 2003. http://image.thelancet.com/extras/03art4432web.pdf 4. Poon LL, Wong OK, Luk W, Yuen KY, Peiris JS, Guan Y. Rapid diagnosis of a coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS). Clin Chem 2003; 49: 953-5. http://sarsreference.com/lit.php?id=12765993 5. WHO Update 71. Status of diagnostic tests, training course in China. http://www.who.int/entity/csr/don/2003_06_02a/en
譯者註：基於連接網站上許多重要訊息值得參考，雖然原書沒有記載，仍將其附註於此，希望對讀者有所助益。
註記一：使用診斷測試要非常小心(WHO Update 39) 現在所使用的diagnostic test都有一些限制在。若是以這些test的結果來判定是否需要治療，可能會使有SARS病毒的病人沒有接受應有的治療，而有機會傳染給他人。
PCR可以在血液、糞便、呼吸道分泌物及組織樣本中，偵測到SARS病毒的遺傳物質。雖然非常專一但缺乏敏感度，因此negative result不代表沒有感染SARS病毒。
ELISA可偵測serum中的SARS抗體，但需在臨床症狀出現後21天才能測得。
免疫螢光染色法(INF)可偵測serum中的SARS抗體，但需在臨床症狀出現後10天才能測得，且需使用fixed SARS virus、免疫螢光顯微鏡和有經驗的技術人員。
SARS病毒亦可用感染cell culture並培養之的方式來偵測，但是需求很高且相當費時。此法是唯一可以證實有活病毒存在的方法。
註記二： SARS診斷測試的取樣 (WHO) 鼻咽(Nasopharyngeal)、口咽(oropharyngeal)樣本適合用於病毒培養、PCR和電顯觀察。 氣管、支氣管肺泡洗出液(BAL)、肋膜液樣本適合用於病毒培養、PCR、電顯觀察、免疫螢光染色和分子生物學研究。 尿液樣本適合用於抗體偵測、病毒培養和PCR。 糞便樣本適合用於病毒培養、PCR和電顯觀察。 結膜樣本適合用於病毒培養、PCR和電顯觀察。 血清樣本適合用於偵測特定的抗體(IgM, IgA, rising IgG)。 血液樣本適合用於標準培養和PCR。 組織樣本適合用於電顯觀察、免疫螢光染色和分生研究。
．呼吸道取樣方法有鼻咽沖洗／吸出，鼻咽、口咽擦拭(swabs)、oropharyngeal swabs和下呼吸道沖洗／吸出四種。(譯者註：呼吸道取樣為容易引發病人劇烈咳嗽被感染，不要站在病人正前方，須嚴格做好自我防護。除非必要，盡量少做。)
註記三: 生物安全考量 世界衛生組織處理SARS病患檢體之生物安全守則 2003/4/25 以下的生物安全守則，是由世界衛生組織所提出，以處理SARS相關的檢體。 SARS檢體必須經由適當生物安全方法來處理，以避免實驗室及相關接觸人員的感染。由於SARS主要傳播的途徑是經由飛沫傳染，故應避免飛沫的產生。至於較詳細的防護設備以及生物安全步驟可以參考下列網址：WHO Laboratory Biosafety Manual, 2nd revised edition, available from the WHO web site。根據最新研究發現，SARS的致病源是之前未明瞭的冠狀病毒，最近稱之為SARS冠狀病毒，或SARS-CoV，因此，所有實驗室應有適當的方法來處理病毒檢體，尤其要特別注意潛在的飛沫傳播、空氣，或是被汙染的器具。若對於檢體是否良好保存有懷疑的話，千萬別進行任何步驟，以避免病毒傳播。
世界衛生組織處理SARS臨床檢體之生物安全守則源自於實驗室對SARS的研究
以下的行為可在生物安全等級第二級實驗室下進行，並遵守二級規範： • 常規性的血清及血液樣本的診斷測試。 • 操作已去活性的病毒顆粒(如已被溶解、固定、或經其他處理)或不完全、無感染性的部份病毒基因。 • 常規性黴菌和細菌培養的檢查。 • 最後將檢體密封以送往診斷實驗室做下一步的檢查。檢體應置於原本加有封條、消毒過的容器內。
以下是世界衛生組織對於在生物安全等級第二級實驗室處理SARA檢體時強烈建議的預防措施： • 任何會產生飛沫之步驟應於生物安全性通風櫥內進行。 • 實驗室人員應穿戴防護衣，包括拋棄式手套、固體式面罩、有袖口的緊密式長袍、安全眼鏡及手術用口罩，或根據曝露於檢體飛沫之危險性大小而選擇全罩式面罩，若是在通風櫥內進行，可免戴全罩式面罩。 • 離心檢體時應使用密封式離心機或加蓋式離心管，而要開封時應於通風櫥內進行。 • 在通風櫥外進行的步驟必須小心，以減少因致病源外洩而曝露的機會。 • 檢驗完後工作檯及器具應確實消毒。可破壞病毒脂質套膜的標準消毒劑應準備充分。 • 生物廢棄物應遵守下列網旨：WHO Laboratory Biosafety Manual, 2nd revised edition所提供的綱要來處理使病毒失去活性。 若是實驗室的防護措施不足，則需考慮將檢體送往防護設備較好的實驗室檢查。
以下的行為必需在生物安全等級第三級實驗室下進行，並遵守三級規範： • 病毒致病源的細胞培養。 • 操作致病源的生長或濃縮的步驟。
當實驗步驟無法在通風櫥內進行時，需合併使用個人防護措施(如呼叫器、面罩)及實驗防護器具(如密封式離心機或加蓋式離心管)
以下的行為必須在動物之生物安全等級第三級實驗室下進行，並遵守三級規範： • SARS檢體的病毒接種到動物。 • SARS檢體的病毒接種到動物後之鑑定。
註記四: 運送SARS相關病人檢體
在國際間運送SARS疑似或可能病例的檢體必須遵照2003年版的International Air Transport Association(IATA) Dangerous Goods Regulation。
目前的IATA規定允許SARS疑似或可能病例的檢體以UN 3373 ”Diagnostic Specimen”的名義來運送以做為診斷或觀察目的。若是要用其他目的的檢體，就必須以標上UN 2814 “Infectious substance, affecting humans (Severe Acute Respiratory Syndrome virus)”的名義來運送。至於要用來培養的檢體則不能以診斷用途來標為UN 3373，而必須標明為UN 2814 Infectious Substance, affecting humans (Severe Acute Respiratory Syndrome virus)。不管是UN 3373或是UN2814，都必須包上三層的包裝來運送： UN 3373診斷用檢體要妥善地包裝以避免運送過程中常見的震動或擠壓造成內容物損傷，並且也要防止包裝或內容物在運送過程中因震動、溫度變化、濕度變化或壓力變化而造成破裂。 第一層包裝要包在第二層包裝裡，並且要能夠在一般運送情況下不會被打破、穿破或是漏出到第二層包裝中。第二層包裝在最外層的包裝之內並且要放進填充緩衝物。而且假設如果內容物漏出到外層，也不可以用會因此而受損的材料來當做包裝的材料。
液體類： 第一層包裝必須要防漏而且容量不可以超過500毫升。在第一層與第二層包裝之間要放進能吸收液體的物質，如果裡面有數個易碎的第一層包裝時，每個易碎包裝之間要分開裹覆並且隔開以避免互相碰撞。放入的吸收物質的量要足夠，以吸收若是全部的內部包裝物漏出時的量，而且必須在外面有一防水的第二層包裝。第一層或第二層包裝必須能容忍在內在壓力約95 kPa(0.95bar)以下時而不會漏出液體。整個的外在包裝也要在4公升之內。
固體類： 最內的第一層包裝要防止內容物篩漏出來，並且重量不能超過500公克。如果裡面有數個易碎的第一層包裝時，每個易碎包裝之間要分開裹覆並且隔開以避免互相碰撞。在外面要有一層防漏水的第二層包裝，整個的外在包裝也要在4公斤之內。
用空中運輸時，最小的包裝起碼外包裝直徑要在10公分以上。包裝的規定也會因一些其他的條件而有所調整。更進一步的運送資訊可洽詢相關主管機關、IATA、商業包裝公司、國際快遞公司等等。
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