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顯微鏡核心實驗室

MICROSCOPY CORE LABORATORY

  

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
                                      儀 器 介 紹  

                             


 

雷射掃描共軛焦顯微鏡

 

1. 何謂雷射掃描共軛焦顯微鏡

 

        在一般顯微鏡下所觀察的影像,都有來自聚焦面 ( focal plane ) 及 非聚焦面 ( out-of focal plane ) 的光,故所提供的影像品質解析較差,也無法一層一層的深入樣品作顯微觀察。

        共軛焦顯微技術利用通過光學針孔光圈 ( pinhole ) 蒐集來自樣品聚焦面的光所行成的影像,將非同一聚焦面的光排除於光學針孔光圈外所形成的共軛焦點影像( confocal image ),去除傳統顯微鏡影像的迷光 ( stray light ) 能提供更高的光學解析,提供更佳的 axial lateral 解析 ( point spread function )(1

        透過此種技術,使用人員可任意依照樣品的厚度,指定樣品的上下點位置,設定每一光學切片的厚度,做連續的光學斷層掃描 (圖 2) ;最後,可重組為一個立體影像 (圖 3) 、連續式的3D電影放映 (影片 1) ,也可作各種角度的旋轉或切面觀察 (影片 2)  

 

2. 雷射掃描共軛焦顯微鏡系統的組成

 

        雷射掃描共軛焦顯微鏡系統,主要是由包含 A. 雷射光源  B. 顯微鏡  C. 共軛焦掃描器  D. 電腦操控工作站  E. 應用軟體 所組成的。

 

A. 雷射光源

        雷射光源可提供極純的單一波長 (monochromatic),能量均一性 (high photon, energy),且雷射光束俱有固定的相位 (coherence),這些特性使得雷射光束可聚焦於一小點,所以可以有效的當作顯微掃描光源。

  雷射光源包括

a.可見光雷射光源 (visible laser)

   包括離子雷射、氦氖雷射以及二極體雷射。

b.紫外光雷射光源 (UV Laser):包括氦鎘雷射和氫離子紫外光雷射。

c.紅外光雷射光源 (IR Laser ) Ti-sapphire Ultrafast laser

(本實驗室配備的雷射光源可參看「本實驗室配備)

 

B. 顯微鏡

·    目前的共軛焦系統絕大部份都可使用於正立或倒立顯微鏡,掃描器可切換組裝於兩款顯微鏡。

·    UVIR提供較高且較寬的波幅修正。

·    光學鏡頭使用高光學解析的高NA油鏡,如PL-APO 40x/1.25 OilPL-APO 63x/1.32 OilPL-APO 63x/1.40 OilPL-APO 100x/1.32PL-APO 100x/1.40

 

C. 共軛焦掃描器

·    採用高解析的point-scanning 的掃描感測系統,基本上,有傳統式的濾鏡系統( filter-based )及新一代的分光光譜系統 (spectral-based),本實驗室的配備屬於後者。

·    在濾鏡系統設計上,主要是利用X-Y掃描鏡來作樣品X-Y座標取像,以Z-stage的升降作為Z-軸的縱身掃描取向,故X-Y-Z在配合時序的控制 (T) 即可作多樣性的組合掃描應用,例如X-TY-TXYXY-TXYZXYZ-T ……等。

·    掃描器的反射螢光偵測可使用CCD CameraPMT (photomultiplier) 來作為光子的感測;至於一般穿透光影像擷取如相位差 (phase contrast), 則是由安裝於顯微鏡內的穿透光感測器所偵測的。

·    本實驗室配備的掃描器為旋轉式K型掃描器 (K-scanner)能提供任何掃描速度的超高光學解析及多度空間的掃描 (nD : multi-dimentional scanning),其解析度達4096 x 4096 x 4096像素

 

D. 電腦操控工作站

·    電腦系統必須能穩定的操控所有軟硬體。

·    使用人員應建立自己的影像處理工作站,以共軛焦系統為影像擷取中心,再將結果單向傳輸至個人的電腦作進一步的編輯處理。

 

E. 應用軟體

·    高階高速的影像處理軟體,人性化的簡易操作是發展的趨勢。目前,都往 Windows NT Windows XP 的作業環境發展。

·    應用軟體除了影像擷取及3D立體重建外,長時間影像擷取記錄,細胞生理離子流應用,多重螢光分析,自動編輯程式等,都已是頗為成熟的發展。

 

3. 雷射掃描共軛焦多光子(雙光子)影像技術

 

        在雷射掃描共軛焦顯微鏡的應用裡,一般都必須使用高能量 (較短波長) 激發光源來激發螢光染劑,因為此高能量才足以改變分子能階,並在回到穩態時釋出較長波長的螢光。所以,一般光源都使用高能量的單光子(single-photon) 可見光雷射 (Ar-Kr / He-Ne laser) 或紫外光雷射 (Ar-UV laser)。然而,螢光染劑的分子本身並不管此激發能量是否來自單光子、雙光子或更多的光子所攜帶的能量,只要能量足夠改變基態能階即可。 (圖 4)

       因此,如果同時使用 2 個以上的雙倍波長光子的能量,以能量相加的交互共同方式,來激發螢光染劑,則此共同的能量,就如同單光子的能量,足以改變能階,並促使螢光染劑釋出與單光子激發後所產生的相同波長的螢光,此即表示雙光子技術。例如 : DAPI Ex (激發光) : 359 nmEm (釋放光) : 461 nm,我們可使用單光子雷射 Ar-UV laser (351 nm) 來激發,也可使用雙光子雷射 Ti-Sapphire (702 nm) 來激發,同樣可得到相同波長 461 nm 的螢光。

       如果同時使用更多個光子共同來激發螢光染劑,使其產生與單光子激發後所產生的相同波長的螢光,此即表示多光子技術

 

4. 使用雙光子雷射掃描影像技術的優點

 

·  可依應用適度取代紫外光雷射 (UV) : 

·    紫外光雷射為單光子造價昂貴

·    紫外光因光傷害問題無法使用於活體細胞

·    紫外光極易散射 (high UV-scattering)傳輸與穿透不易會沉降在樣品的表面層就如同晒傷致使樣品熱傷害

·    紫外光造成毒害致使 DNA 傷害

·   增加取樣的深度能更深入樣品裡層

·   減低螢光漂白的速率增加螢光觀察與掃描時間

·   使用多種染劑時呈像無色差現象

·    較容易將激發光與釋出光的波長分開螢光影像比較不會有重疊現象 (cross-talk)

·    無須感測光針孔所以反射螢光可 100% 被感測

·    可使用絕大部份的螢光染劑尤其是須使用紫外光光源所激發的雷射

·    有效的應用於胞外或胞內離子流定量分析及螢光影像

·    適用長時間影像擷取記錄

 


Reference :
徠卡雷射掃描共軛焦顯微鏡之技術與應用概論,美嘉儀器股份有限公司共軛焦小組編譯,2000年8月。

 

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