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臨床蛋白質體核心實驗室

Clinical Proteomics Core Laboratory

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 
                                   技 術 平 台  

(1)二維膠體電泳及影像分析平台
        二維膠體電泳(2D gel electrophoresis, 2-DE)主要用途在於將複雜蛋白質樣品依序進行第一維(first dimension)的等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)分離,與第二維(second dimension)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)去分離不同分子量的蛋白質。第一維是根據蛋白質的等電點(isoelectric point, pI value)的差異而分離;第二維則是根據蛋白質的分子量大小不同進行分離,最後可在一個二維膠片平面上得到數百~數千個蛋白質點(protein spot),接著根據研究目的的不同,使用者選擇所欲比對的樣品進行影像分析,透過反覆的匹配與比對,可以篩選出在不同膠片之間有顯著變化的spot,或是研究者感興趣的spot,再進行後續之蛋白質鑑定實驗。

  典型的二維電泳膠片分析結果(以SYPRO Ruby染色)

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使用須知

本實驗室目前可操作之等電聚焦(第一維)分離膠條有7cm, 11cm, 17cm等三種尺寸,pH範圍有3-10 nonlinear, 3-10 linear, 4-7, 5-8, 7-10等多種選擇。第二維的SDS-PAGE則根據使用者的需求,自行決定使用10%或12.5%的等比例膠或是4~12%、8~16%的梯度(gradient)電泳膠。在樣品導入的選擇上,使用者可選用被動式水合(passive re-hydration)、主動式水合(active re-hydration)、杯式進樣(cup loading)等3種方式,在染色方面,coomassie blue、silver stain、SYPRO Ruby各有優缺點,建議使用者與本實驗室研商後再行決定。在影像分析部分,採用Progenesis Workstation分析系統,可同時分析數十片膠片影像,本實驗室亦提供完整之教育訓練,可配合使用者進行step by step的教學課程。

整體而言,2-DE需要耗用相當的人力資源,本實驗室目前可提供完整之教育訓練卻難以提供完全代工之服務,建議至少需有1名全職之研究助理較適合投入此一領域。2-DE之分析結果與樣品製備品質息息相關,研究人員需要極為細心地利用各種蛋白質純化方法(例如:TCA沈澱),移除非蛋白質成分(例如:核酸、鹽類、脂類、多醣),否則將嚴重影響第一維的等電聚焦效果。此外,樣品中離子濃度會影響電壓的施加,特別是在萃取蛋白質過程中所導入的鹽類往往大幅度提高樣品的電導度(conductivity),因此本實驗室提供電導度計給使用者隨時量測,期望能達到最佳等電聚焦成果。

2-DE的分析結果是以影像形式呈現,而非一般臨床醫學檢測或分析化學檢測的數值化報表,加上所使用化學藥品達近百種,操作細部分解動作多達數百步。以溶解樣品所需的lysis buffer為例,高親水性之樣品建議使用8 M Urea, 4 % CHAPS, 0.2 % Bio-lyte , 5 mM TBP;偏疏水性之樣品請使用7 M Urea, 2 M Thiourea, 4 % CHAPS, 0.2 % Bio-lyte e, 5 mM TBP,使用者必需特別注意,在疑難排除(troubleshooting)過程中,核心實驗室需仰仗使用者的配合,盡可能地提供操作時的細節,才能快速地使實驗有所突破。

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