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基因醫學核心實驗室
Genomic Medicine Core Laboratory
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簡 介 |
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核心技術
- ABI 3730
毛細管自動核酸定序儀ABI 3730是利用Sanger dideoxy chain termination 的方法，以DNA作為模板加入適量的dNTPs、聚合酶和四種標有不同螢光的核苷酸類似物ddNTPs(ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)在試管內進行聚合酶鏈鎖反應。由於核苷酸類似物缺少3’-hydroxyl group 所以無法與下一個核苷酸的5’-Phosphate group 形成phosphodiester bond，使得這些DNA合成反應會終止在接有核苷酸類似物的位置上，造成長短不一的DNA片段，再藉由高解析度的毛細管電泳技術將這些長短不一的DNA片段分離，最後透過雷射光的激發和CCD的偵測，讀取序列之後再靠電腦將每一片段大小不同的DNA序列組合起來判讀。
- Microarray
DNA微陣列(或稱DNA晶片)是將DNA分子井然有序的結合在一個表面經過處理的晶片上。以DNA微陣列分析基因表現時，先將訊息RNA（mRNA）轉換成互補DNA (cDNA) 再與在微陣列上的DNA發生雜交，雜交的方式是經由華森與克立克雙股螺旋體方式結合。『探針』是一段已知的核酸序列可以被有次序地點在晶片的表面上，而『標的物』是從生物樣品所取得的核酸分子。DNA微陣列晶片的最大功用是可以同時大規模地分析數以萬計的基因表現。
目前兩種基本的DNA晶片依照製造方式及附著在晶片上物質的不同，分別為『寡核甘酸晶片』及『cDNA微陣列』等兩種。有一些寡核甘酸晶片其寡核甘酸直接被合成並排列在一個分離規則有序的矽或玻璃晶片表面；另一些寡核甘酸晶片是先合成寡核甘酸後再點在玻片上。cDNA微陣列則是將準備好的DNA clones固定在玻璃片上，而這些DNA clones是經由聚合酵素連鎖反應(PCR)放大產生的產物，大小約300~2000鹼基對。
在1980年代晚期, Stephen Fodor和他的團隊利用光蝕刻技術(photolithography)合成寡核甘酸晶片，即Affymetrix晶片。每一個標的RNA由11至20對的寡核甘酸探針所構成，每一對探針大約25個鹼基的長度且為標的RNA序列的完全互補即PM (perfect match)，每一對探針對應的寡核甘酸當中會有一些變異鹼基，通常是第13個鹼基變異，即MM (mismatch)可以當作日後訊號分析的控制組。Affymetrix晶片的製作是由寡核甘酸序列分別獨立自動化的排列在晶片上直到四個核甘酸佔據整個晶片四方。這個過程是重覆進行的直到每片晶片上的探針長度都是20-25個鹼基。近年來，科學家開發新的其他方法來製作生物晶片，直接在晶片上合成寡核甘酸。例如，安捷倫公司(Agilent Technologies)利用噴墨印表機的噴頭直接點核甘酸在玻璃片上(http://www.chem.agilent.com )。另一項新的技術，寧玻基因系統(NimbleGen Systems)，利用數碼光處理和快速、高通量的光化學合成寡核甘酸高通量DNA晶片，寡核甘酸的長度可以高達50-70個核甘酸(http://www.nimblegen.com)。
在1990年代中期，Pat Brown與他的團隊發展了墨點微陣列(dot blot microarray)的方法。此種微陣列有三個步驟：第一、準備質體DNA clones，利用聚合酵素連鎖反應(PCR)放大cDNA，這些放大的cDNA序列都是在早期的人類基因體計畫(Human Genome Project)所提供出來的。第二、利用點片機器將DNA自動化點至玻片表面上。第三、玻片的後製處理動作(UV照射以及烘乾)。利用cDNA微陣列分析基因表現有以下四個步驟:第一、檢體的準備以及標定螢光。第二、雜交反應。第三、洗滌去除雜質。第四、影像掃瞄及分析。使用雙色系統的生物微陣列通常會使用兩組不同的訊息RNA (mRNA)檢體，每組檢體分別標定不同的螢光物，通常是使用Cy3(綠色)以及Cy5(紅色)。這兩組檢體通常會有一組當控制組(control)檢體，另一組則是實驗組(test)檢體，將兩組檢體一起雜交在含有cDNA探針的玻片上，經過洗滌處理，將玻片用掃瞄機掃瞄螢光結果，掃瞄機有兩種顏色的雷射，輸出兩個單色的圖像再經過偵測器測量兩個標示的雜交信號比率，結果就呈現在晶片上會有紅綠兩種不同的顏色圖像。
- Illumina MiSeq System
Illumina MiSeq定序儀為桌上型定序儀。在提供一貫優良品質數據的前提下，使用者可依據實驗所需及預算考量彈性選擇多種不同定序通量及讀長。依據MiSeq可提供高通量定序資料的特性，最適合本機的定序實驗為小型基因體定序(細菌、病毒)、16S Metagenomics菌相分析、目標基因群序列分析(amplicon, gene panel)、染色質免疫沉澱片段定序、微型RNA定序及甲基化序列分析等。
隨著倍增的基因定序資料與日益龐大的基因體資料庫，日趨複雜的生物醫學研究實驗設計中，後端資料整理、分析以及研究疾病的關聯性的比重將顯著增加。生物資訊學乃是一個結合生物學、計算機科學及資訊科技所形成的新研究領域，最終的目標是發現新的生物認知，進而建立生物系統的整體概念。次世代定序分析即是以資訊學的方式整合不同層面的海量數據（Big Data）幫助研究者更進一步了解基因體變異疾病的致病因子及其機制。次世代定序產生的大量定序資料(原始檔案格式FASTQ檔)，須藉由電腦程式運算進行分析，初步的定序分析皆以序列比對與變異點辨認為主，一般採用常見的序列比對程式bwa、bowtie、bowtie2，完成後寫入BAM檔，再以變異點辨認程式gatk、freebayes等分為單點變異（SNP）與小片段變異（INDEL）兩種型態辨認，同時會計算變異點讀值數量與質量及基因型態判定，最後寫入VCF檔，進而進行變異點功能註釋，同時，可以將相同條件重複分析案件建立標準流程，也可進行分析流程的改善。最終目的是將不同的質體學資料整合，找出基因調控、蛋白質交互網路、細胞訊息傳送、代謝網路和藥物作用等等，於系統層次上提供疾病問題之治療方略。核心實驗室新建立了次世代定序資料分析平台(CLC Genomics Workbench)使用環境，提供長庚體系之研究人員一套完善的研究設備，目的是為了建立完整的臨床與基礎生物醫學相關研究之次世代基因定序與雲端資料庫，並且進行整合性的系統生物醫學研究和提供基因定序資料的處理與探勘。
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