林口院區 生殖醫學中心胚胎醫檢師 林傑瑜

一、前言

　　隨著人工生殖技術不斷地進步，且在希望達到最高懷孕率、減少多包胎的要求之下，冷凍胚胎的實驗技術也更加受到重視。

　　自1983年Trounson等人利用慢速冷凍法將分裂期的胚胎冷凍，再進行解凍植入，完成了世界第一例人類冷凍解凍胚胎活產的報告，慢速冷凍技術也因此被廣泛的用於臨床上；之後又發展出可冰凍卵子及囊胚期胚胎之慢速冷凍法，而近年來玻璃化急速冷凍法(Vitrification)可將卵子及任一時期胚胎進行冷凍，更是一種操作簡單且效率更佳的冷凍方式。

二、冷凍原理

　　冷凍保護劑是進行冰凍時最重要的添加物，冷凍保護劑常為小分子，可進入細胞內置換水分，維持細胞內外滲透壓平衡及保護胞器；而sucrose, Ficoll等大分子則可在細胞外產生高滲透壓的環境，降低水分回流進入細胞的速度，減少細胞水腫的傷害。

　　慢速冷凍法中有一很重要的步驟，即溫度降至零下5-7度的結冰臨界點時執行「植冰」(seeding)的動作，於是細胞外的水分開始結冰，細胞外的水分相對的減少，由於植冰造成的冰晶，使得細胞外電解質相對濃度開始升高，藉以產生暫時性的細胞外高張溶液，使細胞脫水更完全，減少細胞內結晶冰塊的產生，降低細胞脹破的風險。

不論卵子或胚胎在冷凍過程中易產生的傷害有三種：

1. 細胞內冰塊結晶的形成
2. 滲透壓的改變
3. 溫度的變化

　　導致透明帶及細胞裂傷、細胞骨架改變進而造成細胞死亡，而玻璃化急速冷凍法的原理則是以高濃度的冷凍保護劑，江細胞內水分脫水至細胞外，然後直接將卵子或胚胎置入攝氏零下196度的液態氮中，使細胞內的物質瞬間變成高黏稠的玻璃化物質，因此避免了細胞內冰塊結晶的產生，細胞也避免了傷害。

三、慢速冷凍法及玻璃化急速冷凍法的特色比較

　　慢速冷凍法

1. 逐步增加冷凍保護劑的濃度來控制細胞脫水及保護劑進入的速度；常用的保護劑為1.2-propanediol，應用於卵子及分裂期胚胎的冷凍，而囊胚期胚胎的冷凍則用glycerol作為冷凍保護劑。
2. 利用人工植冰控制結冰方向，配合可程式電腦降溫機慢慢脫水及降溫，達到細胞脫水的效果。
3. 冰凍過程較費時(﹥2小時)且消耗較多的液態氮。

　　玻璃化急速冷凍法

1. 常用的保護劑為ethylene glycol、DMSO，相對濃度較慢速冷凍法高很多。
2. 步驟省時簡單，液態氮消耗少。
3. 將含胚胎的少量冷凍液(體積愈小愈好)至於載體(如：grid、cryoloop、cryotop、cryoleaf等)上，再快速放入液態氮中，全程須具備熟練的操作技巧，以縮短操作時間，避免細胞傷亡。

四、結論

胚胎冰凍解凍植入後是否成功懷孕影響的因素很多，冰凍解凍的技術只是其中一個必要條件，其他尚有：

1. 冰凍胚胎的數目和品質
   胚胎冰凍前的細胞若無碎片、且透明飽滿對稱為較好的胚胎；一班而言分裂為2、4、8細胞的胚胎較3、5細胞的胚胎好，因為單數細胞的胚胎可能正值細胞染色體複製期，較容易受到冷凍傷害；而解凍後的胚胎若植入多於3個，則懷孕率較只植入1、2個胚胎高。
2. 病人本身的條件
   統計資料顯示年紀較輕的病人（＜35歲）懷孕率較高；一般病人解凍胚胎多採用配合自然週期來準備子宮內膜，若為PCOS或無排卵的病人，可用GnRHa和動情激素（如：Progynova、Climara等）來治療，待子宮內膜厚度夠，則開始給予黃體激素（Utrogestan）5至7天，再植入解凍胚胎。

　　總之，在客觀條件允許下，純熟的冰凍解凍胚胎植入技術，需靠臨床醫師的妥善治療及實驗室人員熟練的技巧和完善的品質管制，期待隨著各項技術的更新與發展，能使試管嬰兒在臨床上的應用更上一層樓。