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除了少數意外傷害外，幾乎所有的人類疾病都與遺傳體質有關。例如，癌症的發生常伴隨著遺傳物質改變的現象，這些變化可能是經由增減了致癌基因(oncogenes)或是腫瘤抑制基因(tumor suppressor genes)，而導致病變。為了探討遺傳物質變化，Kallioniemi等人於1992年提出了比較性基因體雜合分析(Comparative Genomic Hybridization, CGH)技術，用以觀測在23對染色體上各區域基因體量的變化。有些研究人員則結合CGH與傳統細胞染色體分析(cytogenetics)，用於產前遺傳診斷與胚胎著床前基因診斷(Preimplantational Genetic Diagnosis, PGD)，期望能發展出新的基因篩檢方式( Voullaire, et al. 2000)。
CGH的原理係使用正常細胞與待測細胞的基因體 DNA，分別標定兩種不同顏色的螢光染劑後，同時與固定於玻璃片上的正常細胞中期染色體(metaphase chromosome)作競爭性雜合反應，再以一般螢光顯微鏡觀察讀取訊號，觀察那些特定位置的DNA有增加（gain）或減少（deletion）？然而CGH受限於模板(template)染色體太大與光學顯微鏡解像力(只能到0.2 um)之限緣故，只能偵測到10個百萬鹼基(Mb)大小的基因體變化。因此，有些研究學者提出以微陣列晶片來分析的概念( Solinas-Toldo et al, 1997)，將基因體DNA片段有順序的排列在玻璃片或尼龍膜上，來取代傳統的細胞中期染色體為模板，這便是以微陣列為基礎的比較性基因體雜合技術(Microarray-based comparative genome hybridization)。其優點包括：可將偵測的靈敏度提高至數百個千鹼基(Kb)大小、不必繁瑣地製備染色體模板、自動化的微陣列晶片製程可大大縮短實驗時間、對於有套數變化的區域可直接找出所在基因的序列資訊、與提昇實驗的準確性。以下就實驗內容作一簡單介紹：
微陣列晶片的製作：
長庚醫院基因體醫學研究核心實驗室(Genomic Medicine Research Core Laboratory, GMRCL)現有7,334 個定序確認(sequence-verified)的互補DNA(complement DNA, cDNA)，為了以統計方法降低實驗誤差，每一個基因在玻片上均有兩點重複，所以每片基因晶片約有一萬五千點DNA。在晶片製程中，先以PCR方法在96孔微盤中大量複製cDNA，並以PCR Purification Kit (Qiagen) 純化PCR產物，經過1.2% agarose gel確認DNA品質，操作過程中大都以TECAN自動分注儀進行，以降低人為誤差。
將製備完成的cDNA clones以打點機(Q-Array, Genetix) 應用毛細管沾點法打點到特殊玻璃片(Amino-Silane Coated UltraGAPS Slide, Corning, USA)上，DNA clone的濃度至少150 ng/ul以上，打點完成再以紫外光照射(UV crosslink, Stratagene)固定cDNA於玻片上。要能將cDNA microarrays用來分析基因體變異，我們先經過UniGene Cluster (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)分析，找出5,777個有功能性註解(Functional annotations)的基因，並透過UCSC基因體生物資訊中心Goldpath (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)資料庫，取得這些基因在人類基因體內的染色體基因圖譜(cytogenetic map) 。
生檢體之基因體DNA萃取
適用本技術之檢體的來源廣泛。我們先以一些常用細胞株、來自血液、組織或羊水細胞培養的臨床檢體作為實驗測試。基因體DNA的萃取以市面生產的DNA萃取套組(DNA isolation kit, Gentra)進行，經測量吸光值計算濃度與agarose gel電泳確認DNA品質後，再進行螢光標定工作。
螢光標定與微陣列的雜合反應
我們採用Pollack(1999)報告的方法，以Directed Labeling Method進行螢光染劑標定。在至少2 ug基因體 DNA中，加入DNA合成酵素(Klenow DNA Polymerase I)與帶有螢光染料的鹼基（通常為Cy3-dUTP或Cy5-dUTP），當合成反應進行時，Cy3 / Cy5-dUTP會併入(incorporation)合成的DNA。將參考組(reference)與實驗組(test)DNA分別用兩種不同顏色的螢光染劑標定後，便可與微陣列晶片進行利用競爭性雜合反應。
影像掃描與分析
將雜合反應完成的微陣列晶片以晶片螢光掃描儀(Virtek-ChipReader)擷取每個基因的螢光影像，再以分析軟體GenePix 4.0 (Axon Instruments)將其數值化進行資料分析。依實驗需求統計上將數據經對數轉換，再以局部線性迴歸方法(Locally Weighted Sactterplot Smoother, Lowess)針對不同的螢光強度進行標準化(Normalization)處理，去除資料中系統的變異，增加微陣列分析的可信度。再將雙色螢光比率(ratio)值，依各基因在染色體上位置依序排列，設定50點cDNA為一組資料，用電腦分析程式於人類基因體序列上重覆地移動以取得多組的數據，再利用統計學t-檢定(t-test) 之P-value值來檢定組別間是否有顯著差異的存在。我們設定當P-value小於十的負四次方則視為有顯著差異。
驗證本技術的實例
我們利用Microarray-based CGH對一些已經過診斷的臨床檢體進行實驗測試。
- 在染色體構造異常方面：如同傳統細胞染色體分析一樣，重複兩次實驗皆可偵測出一個羊水細胞檢體的第10號染色體長臂序列(q22-26)擴增現象，而且精密度可到數百個千鹼基(Kb)大小。另一檢體在傳統細胞染色體分析的診斷為其父親在第四號與第十二號染色體有轉位現象(translocation)，如同傳統的CGH一樣，Microarray-based CGH無法偵測到平衡轉位現象(balanced translocation)，但胎兒檢體則意外的多遺傳了一段第12號染色體長臂序列，經偵測在第12號染色體長臂序列(q21-q24)有擴增一段，然而特別的是在第19號染色體發現短臂序列(p13.3)有缺失情況，經檢視檢體的父母雙方，則在父方偵測出相同位置的情況19p13.3(-)，母方則無，我們正以其他方法進一步驗證中。在染色體數目異常上，使用三倍染色體13、18、21、45X或48XXY+trisomy 18檢體作為測試，如同傳統細胞染色體診斷皆可正確偵測出異常狀態。
- 在探討腫瘤細胞染色體變化上：以同時缺失腫瘤抑制基因p53 (位於染色體17p13) 與帶有功能缺陷pRB (位於染色體13q14)而著名的Saos2骨癌細胞為例，我們可發現1p、1q、6p、8q、17q、19q與21q有擴增片段;在1q、2p、5q、8p、10p、12q與14q有缺失的片段，而18號染色體整條都有缺失的現象。有研究指出基因體如在8q24有擴增及5q15有缺失的現象易與 p53突變有關( Ajay et al. 2001)，而很有趣地，我們的實驗結果也在相同位置有著類似的變異發生。然 而，這些基因體區域缺失的相互因果關係如何，則有待其他研究方法加以證實。
本技術的應用潛力
Microarray-based CGH確實可快速、有效地大量偵測基因體區域是否異常，探討異常基因體變化與疾病的相關性，當結合基因表現微陣列(gene expression microarray analysis)資料時，更可了解疾病發生過程中，那些基因體區域可能是肇因？以便進一步用其他分子生物學研究找出疾病的分子機制。近來，學者( Lage, et al 2003)更思考如何把微量DNA以全基因體放大技術（whole genome amplification）後，結合Microarray-based CGH，希望在不久的將來可應用到著床前胚胎診斷，快速的鑑定胚胎細胞的基因體健康狀態。
參考文獻
- Ajay N. et al.(2001) Quantitative analysis of chromosomal CGH in human breast tumors associates copy number abnormalities with p53 status and patient survival. PNAS. 98:7952–7957
- Kallioniemi A, et al.(1992) Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 258:818-821
- Lage JM,et al.(2003) Whole Genome Analysis of Genetic Alterations in Small DNA Samples Using Hyperbranched Strand Displacement Amplification and Array-CGH. Genome Research 13:294-307
- Pollack, J. R.,et al.(1999) Genome-wide analysis of DNA copy number changes using cDNA microarrays. Nature Genetics 23: 41–46.
- Solinas-Toldo S, et al. (1997) Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalance. Genes Chromosomes Cancer 20:399–407.
- ??? Voullaire L, Stater H, Williamson R, Wilton L. (2000) Chromosome analysis of blastomeres from human embryos by using comparative genomic hybridization. Human Genetics 106:210-217.
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