--細菌性感染症之分子診斷 --

一、細菌性感染症快速鑑定介紹：

本組主要利用聚合脢連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)，針對臨床檢體中的病原菌，包括結核菌(Mycobacterium tuberculosis complex)、尿漿菌(Ureaplasma urealyticum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)等，進行快速偵測，提供迅速且正確的檢驗結果，協助臨床醫師正確診斷常見的細菌性感染症。

二、病原菌及實驗原理介紹

1.          結核菌(Mycobacterium tuberculosis complex)

(a)         結核菌的培養緩慢（費時且靈敏度不高），如能在數天之內，利用 PCR技術快速且專一的放大結核菌DNA至容易偵測數量，對於結核病，特別是肺外結核病（如結核性腦膜炎）之診斷，將有很大助益。

(b)         本實驗室選擇insertion sequence IS6110中一段123-bp序列作為target sequence，該序列為Mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis，M. bovis，M. africanum，M. microti)所特有。根據文獻指出M. tuberculosis具有很多該重覆序列(10~20 copies)，相較之下 M. bovis則較少(1~5 copies)。由於具有專一性及重覆性，IS6110可作為理想的target sequence。

2.           尿漿菌(Ureaplasma urealyticum)

(a)         U. urealyticum是泌尿生殖道常見的感染菌，為non-chlamydia, non-gonococcaal urethritis 及 acute prostatitis的主要致病菌。在受感染的懷孕婦女，會造成chorioamnionitis，preterm delivery，及congenital pneumonia .並且在生產的過程中易傳染給新生兒，引起新生兒的呼吸道症狀，中央神經系統感染及感染後併發的腦膜炎。

(b)       本檢驗針對U. urealyticum 之 urease gene為標的，複製一段429-bp大小的DNA片段，以期快速偵測檢體中U. urealyticum DNA。

3.           百日咳菌(Bordetella pertussis)

(a)         B. pertussis在臨床上會引起百日咳(pertussis)，細菌培養法為實驗室鑑定之標準，然而其費時（約5-7天），易受污染，靈敏度不高且會因藥物治療，接種疫苖，採檢時機等因素影響其檢出率。因此，本實驗室以PCR為基礎發展分子診斷技術，以期快速偵測檢體中B. pertussis DNA。

(b)       本檢驗針對B. pertussis之insertion sequence IS481為標的，複製出203-bp 大小之DNA片段，以期快速偵測檢體中B. pertussis DNA。

三、臨床應用及適用範圍：

1.           結核菌(Mycobacterium tuberculosis complex)

可應用在臨床上懷疑結核分枝桿菌感染者之早期偵測及快速鑑定，尤其適用於痰抹片呈抗酸性染色陽性的病患的快速診斷。由於偵測目標為DNA，無法分辨病患是屬於結核病的潛伏期或是活動期，所以建議應用在病患尚未使用抗結核藥物治療前的早期偵測，不適用於治療的後續追蹤。

2.           尿漿菌(Ureaplasma urealyticum)

可應用在臨床上懷疑U. urealyticum感染者之快速診斷，包括婦女的泌尿生殖道感染以及新生兒的呼吸道感染。

3.           百日咳菌(Bordetella pertussis)

可應用在臨床上懷疑是B. pertussis引起的百日咳感染者之快速診斷，尤其適用於已接受過疫苗接種的患者，或是當患者的臨床症狀不明顯或是在疾病的晚期，或是已先行用藥治療的患者。

四、品管：

1.           DNA萃取控制組(Extraction control)：

在抽取sample DNA的同時，需加做一管negative control，即以水取代檢體，進行整個流程，此為extraction negative control，以作為監控操作流  程中，任一步驟或試劑是否有污染情況發生。（若抽取sample DNA的方式不一致，須做不同的extraction negative control）。

2.           PCR內部品管控制組(Internal control)：

為排除因未知抑制因素而造成的PCR偽陰性結果，及確認有萃取到人體細胞DNA，以上三種病原體檢測皆另加作一管對照組，進行檢體中的β-globin gene的偵測，如果可以正確複製出PCR產物，ㄧ方面可確認檢體內無PCR inhibitor，ㄧ方面可確認有萃取到人體細胞DNA，判讀PCR結果時，可排除偽陰性的可能。

3.           陽性控制組(Positive control) ：

(a)         結核菌(Mycobacterium tuberculosis complex)：

(1) Positive control：以相當於100 copies/L的質體DNA，作為Positive control。

(2) Weak positive control：以相當於10 copies/mL的質體DNA，作為Weak positive control。

(b)      尿漿菌(Ureaplasma urealyticum)：

(1) Positive control：以相當於 23 copies/ml的質體DNA，作為Positive control。

(2) Weak positive control：2.3 copies/ml的質體DNA，作為Weak positive control。

(c)         百日咳(Bordetella  pertussis)：

(1) Positive control：以相當於0.5 genomic copies 的B. pertussis菌種DNA，作為Positive control。

(2) Weak positive control：以相當於0.05 genomic copies的B. pertussis菌種DNA，作為Weak positive control。

4.           陰性控制組(Negative control)：

在操作PCR時，須作一管reagent negative control，即取水代替檢體DNA進行PCR反應。

5.         上述PCR反應於判讀時須注意：

DNA萃取控制組(Extraction control)、陰性控制組(Negative control)應為陰性；陽性控制組(Positive control)、PCR內部品管控制組(Internal control)為陽性。以上controls皆通過才可發報告；若上述三點其中一點不成立，須重覆PCR，並填寫LCP0201-RA檢驗醫學科異常處理表。

五、臨床靈敏度及特異性：

1.           結核菌(Mycobacterium tuberculosis complex)

分析2002年至2008年之間，共1287隻臨床檢體的PCR與Culture的結果，以Culture結果為標準，可得PCR之評估結果如下：

Clinical sensitivity = 84.9%，Clinical specificity = 97%，Agreement = 96%，Positive predictive value = 72.0%，Negative predictive value = 98.6%。

2.           尿漿菌(Ureaplasma urealyticum)

分析87年10月至88年8月之間，共88隻臨床檢體的PCR與Culture的結果，以Culture結果為標準，可得PCR之評估結果如下：

Clinical sensitivity=100%，Clinical specificity=93%

Agreement = 94%，Positive predictive value = 77%，Negative predictive value = 100%

3.           百日咳菌(Bordetella pertussis)

分析1997年6月至2001年12月之間，共193對鼻咽拭子之PCR與Culture的結果，以Culture結果為標準，可得PCR之評估結果如下：

Clinical sensitivity = 100%，Clinical specificity = 92%

Agreement = 93%，Positive predictive value = 44%，Negative predictive value = 100%